实验步骤分为 3’ 和 5’ 两部分
一、3’RACE1. 反转录生成 cDNA 模板
（1）配制反转录混合液：以 20uL 反转录终体系为例，将各组分混合于离心管内，使各组分终浓度如下（冰上操作）：1x 反转录缓冲液，1.3mM dNTP 溶液，12.9 mM DTT，50ng QT 引物，10 U RNA 酶抑制剂；
（2）新取一离心管，加入 1ug Poly（A）RNA 或 5ug 总 RNA，加 ddH2O 补足至11.25uL，80°C 加热 3min 后，立即置于冰上迅速冷却，10000g 4°C 离心 5 sec；
（3）将第（2）步处理后的 RNA 加入到第（1）步配制的反转录混合液中使总体积为 20uL，加入 200 U SuperScript II 逆转录酶，在室温(22-25°C)下混合后静置 5 min，然后42°C 加热 1 h，50°C 加热 10 min；而后 70°C 加热 15min 终止反应，离心机最高速室温瞬离 5 sec；
（4）加入 1.5 U RNA 酶 H 后 37°C 孵育 20 min 以降解 RNA 模板；
（5）加入 Tris-EDTA 溶液将反应混合物稀释至 1mL 得到 cDNA 模板溶液，保存于 4°C，禁止冻融。
2. 第一条 cDNA 链的合成
（1）将各组分混合于 0.2mL PCR 离心管内，使各组分终浓度如下（冰上操作）：1x Hercules 热启动聚合酶缓冲液，200uM dNTP 溶液，0.05 U Hercules 热启动聚合酶，加ddH2O 补足至 50uL；
（2）加入 1uL cDNA 模板溶液以及引物 GSP1 和 Q0 各 25pmol，混合均匀，并同时设立一个仅不含 cDNA 模板的阴性对照反应管，以确定阳性信号来源于 cDNA；
（3）放入 PCR 仪，98°C 5 min 变性， GSP1 的 Tm 值温度 2min，72°C 40 min 延伸；
（4）进行循环：94°C 10 sec，GSP1 的 Tm 值温度 10 sec，72°C 3 min，循环 30 次，其中最后一循环 72°C 15 min，结束后冷却至室温，得到第一条 cDNA 链产物溶液。
3.第二条 cDNA 链的合成
（1）将第一条 cDNA 链产物溶液用 Tris-EDTA 溶液稀释 20 倍；
（2）将各组分混合于 0.2mL PCR 离心管内，使各组分终浓度如下（冰上操作）：1x Hercules 热启动聚合酶缓冲液，200uM dNTP溶液，0.05 U Hercules 热启动聚合酶，加ddH2O 补足至 50uL；
（3）取 1uL 稀释后的第一条 cDNA 链产物溶液，加入引物 GSP2 和 Q1 各 25pmol，混合均匀，并同时设立一个仅不含 cDNA 模板的阴性对照反应管；
（4）放入 PCR 仪，98°C 5 min 变性；
（5）进行循环：94°C 10 sec，GSP2 的 Tm 值温度 10 sec，72°C 3 min，循环 30 次，其中最后一循环 72°C 15 min，结束后冷却至室温，得到第二条 cDNA 链产物溶液。
4.产物分析
使用凝胶电泳分析最终的PCR产物，对cDNA鉴定可通过杂交或测序。
二、5’RACE
1. 反转录生成 cDNA 模板
（1）配制反转录混合液：以 20uL 反转录终体系为例，将各组分混合于离心管内，使各组分终浓度如下（冰上操作）：1x 反转录缓冲液，1.43mM dNTP 溶液，2.88mM DTT；
（2）新取一离心管，加入 50ng GSP-RT 引物，1ug Poly（A）RNA 或 5ug 总 RNA，加ddH2O 补足至 12uL，80°C 加热 3min 后，立即置于冰上迅速冷却，10000g 室温离心 5 sec；
（3）将第（2）步处理后的RNA加入到第（1）步配制的反转录混合液中共 20uL，加入 200 U SuperScript II 逆转录酶，轻柔混合后 42°C 加热 1 h，50°C 加热 10 min；而后 70°C 加热 15min 终止反应，离心机最高速室温瞬离 5 sec；
（4）加入 1.5 U RNA 酶 H 后 37°C 孵育 20 min 以降解 RNA 模板；
（5）加入 Tris-EDTA 溶液将反应混合物稀释至 400uL 得到 5’ 端无尾 cDNA 溶液，保存于4°C，禁止冻融。
2. 第一链 cDNA 的 Poly（A）加尾
（1）使用 QIAquick 过滤器产品说明书或其他等效产品除去5’端无尾 cDNA 溶液中多余的引物，最终体积不应超过 15uL，不足的用 ddH2O 补足至 15uL，
（2）加入 4uL 加入 5x 末端转移缓冲液4 uL， CoCl2 1.2 uL，dATP 4 uL， Tdt 10 U。同时设置一个用等量蒸馏水替代 Tdt 的阴性对照反应管；
（3）放入 PCR仪，37°C 5 min，65°C 5min，再用 Tris-EDTA 溶液稀释至 500uL，得到5’端 cDNA 溶液，保存于 4°C；
3. 第一条 cDNA 链的合成
（1）将各组分混合于 0.2mL PCR 离心管内，使各组分终浓度如下（冰上操作）：1x Hercules 热启动聚合酶缓冲液，200uM dNTP 溶液，0.05 U Hercules 热启动聚合酶，加ddH2O 补足至 50uL；
（2）加入1uL 5’ 端 cDNA 溶液以及引物 GSP1、Q0和 QT各25pmol，混合均匀，并同时设立一个仅不含 cDNA 的阴性对照反应管，以确定阳性信号来源于cDNA；
（3）放入 PCR仪，98°C 5 min 变性，冷却至 48°C 保温 2min，72°C 40 min 延伸；
（4）进行循环：94°C 10 sec，GSP1 的 Tm 值温度 10 sec，72°C 3 min，循环 30 次，其中最后一循环 72°C 15 min，结束后冷却至室温，得到第一条 cDNA 链产物溶液
4.第二条 cDNA 链的合成
（1）将第一条 cDNA 链产物溶液用 Tris-EDTA 溶液稀释 20 倍；
（2）将各组分混合于 0.2mL PCR 离心管内，使各组分终浓度如下（冰上操作）：1x Hercules 热启动聚合酶缓冲液，200uM dNTP溶液，0.05 U Hercules 热启动聚合酶，加ddH2O 补足至 50uL；
（3）取 1uL 稀释后的第一条 cDNA 链产物溶液，加入引物 GSP2 和 QI 各 25pmol，混合均匀，并同时设立一个仅不含 cDNA 模板的阴性对照反应管；
（4）放入 PCR 仪，98°C 5 min 变性；
（5）进行循环：94°C 10 sec，GSP2 的 Tm 值温度10 sec，72°C 3 min，循环 30 次，其中最后一循环 72°C 15 min，结束后冷却至室温，得到第二条 cDNA 链产物溶液。
5.产物分析使用凝胶电泳分析最终的 PCR 产物，对 cDNA 鉴定可通过杂交或测序。